CAMPIONAMENTO DEL SUOLO 5 ambientale

Campionamento 5BB indirizzo ambientale del giorno 16/12/19 dell’Istituto Biotecnologico Monna Agnese di Siena (Prof. Tomeo Americo e Prof.essa Penon Antonella).

Il campionamento è stato effettuato in zona Laterino (Siena), scavando all’incirca fino a 15 cm di profondità come suggerito dalle linee guida sul campionamento di suolo fornito dall’ARPA Veneto (L’interpretazione delle analisi del terreno. Strumento per la sostenibilità ambientale). Il campionamento è avvenuto in diversi punti e sono stati campionati 3 tipi di suolo.

Una volta effettuato il campionamento, siamo tornati in laboratorio e abbiamo lasciato essiccare i campioni di suolo. L’essiccazione è molto importante per la determinazione di parametri fisici del suolo come ad esempio: tasso di umidità, densità e il tipo di suolo; per la determinazione di parametri chimici come ad esempio: il valore di pH, la valutazione di specie chimiche come ad esempio: potassio, fosforo, ammonio, nitrati/nitriti; per la determinazione della microflora microbica del suolo aerobia e anaerobia.

Il kit che è stato utilizzato per la determinazione dei parametri chimico-fisici è il kit VISOCOLOR.

Per la determinazione di tutti i parametri, sopra elencati, abbiamo scelto un campione di suolo che fosse rappresentativo e il più possibile omogeneo.

Si pesano 200g di suolo con l’utilizzo di una bilancia analitica e si lasciano essiccare per 24 ore. Questa quantità servirà per le analisi chimico-fisiche del suolo. Mentre per la determinazione della microflora microbica del suolo, si pesano 10 g di suolo.

Passate le 24h, si pesa nuovamente il suolo e si procede alla determinazione dei parametri fisici, cominciando dal tasso di umidità del terreno. Per la determinazione del tasso di umidità si applica la formula:

%umidità= (Massa iniziale del campione prima del trattamento)- (Massa del campione dopo trattamento)   x 100

                                                     (Massa iniziale del campione prima del trattamento)

dove la massa iniziale di suolo è di 200g, quella finale è di 173.49g e, quindi, la percentuale di umidità del nostro campione è del 13.25%.

Una volta determinata la percentuale di umidità, si procede con la determinazione della densità del campione di suolo. Per la valutazione della densità abbiamo utilizzato un cilindro graduato da 100 ml e la bilancia analitica. Prima di utilizzare il campione e versarne il contenuto nei 100 ml del cilindro, è stato annotato il peso esatto del cilindro, che è di 89.13g.

Una volta annotato il peso, si procede con l’aggiunta di terreno essiccato all’interno del cilindro, fino ad arrivare ai 100 ml. Una volta terminata la fase di aggiunta, si annota il peso (175.83g). Il peso esatto di suolo è dato dalla differenza tra la massa del cilindro con il campione di suolo e la massa del cilindro vuoto. Il valore estrapolato è di 86.70g.

La densità si calcola: Massa suolo (86.70 g)/Volume cilindro(100 ml) e il valore è di 0.867g/ml.

Infine l’ultimo parametro fisico da determinare è il tipo di suolo. Quello che è stato fatto è un’analisi della sedimentazione, sottoponendo il nostro campione a sbriciolatura e rimozione del materiale grossolano con l’ausilio di un setaccio.

Una volta effettuato questo pretrattamento, il nostro campione è stato inserito in un cilindro di vetro graduato, dove ogni lettera disegnata sul cilindro, corrisponde ad una frazione del suolo. Sul kit è presente una tabella di riferimento, che indica con precisione a quale frazione corrisponde una determinata lettera.

Successivamente abbiamo portato a volume con acqua distillata fino alla linea F e abbiamo aggiunto 10 gocce di una soluzione di pirofosfato, contenuta nel kit. L’aggiunta di pirofosfato impedisce la flocculazione delle particelle di argilla e quindi consente di mantenere intatta questa frazione. Successivamente si agita vigorosamente il cilindro con tappo a vite fino a quando non si ha una dispersione uniforme della miscela. Una volta che la nostra miscela è diventata il più possibile omogenea, si lascia riposare su banco e si aspetta che avvenga la separazione delle frazioni del suolo (limo, sabbia e argilla). Dopo 18 secondi le particelle di sabbia si sono sedimentate e si valuta l’altezza raggiunta dalla frazione di suolo sul cilindro. Dopo di che si compara l’altezza raggiunta con le lettere presenti sul cilindro e si fa una comparazione con i dati presenti nella tabella.

Nel nostro caso il campione di suolo è argilloso.

Per la determinazione dei parametri chimici abbiamo dovuto preparare due soluzioni di estrazione: la soluzione di estrazione A, per la determinazione del pH, dei nitriti, nitrati e ione ammonio; la soluzione di estrazione B, per la determinazione del fosforo e del potassio.

La soluzione di estrazione A è stata preparata aggiungendo 1ml di una soluzione di CaCl₂ 0.0125M (mol/L) a 100 ml di soluzione di estrazione A concentrata (standard) e 100 ml di acqua distillata (tutte le soluzioni sono già presenti nel kit).

Si pesano 100g di campione di suolo, già precedentemente trattato, in un barattolo di plastica, già presente nel kit e si versano all’interno 100 ml di soluzione di estrazione A, già pronta. Si agita vigorosamente per due minuti con una spatola metallica e si lascia per 15 minuti. Durante questo periodo è necessario ripetere l’operazione più volte, in modo tale da facilitare la sedimentazione.

Una volta trascorsi i 15 minuti si prende un cilindro da 100 ml, si inserisce un imbuto separatore con filtro a pieghe MN 616 ¼ (presente nel kit) e si filtra il contenuto che si trova all’interno del barattolo. Il filtrato (estratto di suolo A) viene recuperato e sottoposto ad analisi per la determinazione del pH.

Per la determinazione del pH si usa un metodo colorimetrico mediante utilizzo di strisce reattive con indicatore di pH. Si prendono due provette di cui una si riempie con acqua distillata e l’altra con l’estratto di suolo A. Queste provette vengono poste sul blocco VISOCOLOR (fornito dal kit), inserendo nel perno un disco rotante colorato che legge i valori di pH da 4.0 a 10.0. Nella provetta dove viene inserito l’estratto di suolo, si aggiungono 4 gocce di un reagente HE a pH 4.0-10.0 e si agita. Quando la provetta inizia a emettere colore si gira il disco e si confronta il colore della provetta con la scala colorimetrica presente sul disco. A ogni colore corrisponde un valore di pH. Se si vuole essere sicuri, si immerge per 3 secondi una striscia reattiva con indicatore all’interno della provetta con l’estratto, si lascia asciugare e si confronta il colore con la scala colorimetrica presente sulla scatola di strisce. Una volta effettuato il confronto, si annota il valore di pH.

Nel nostro caso forniamo un range di pH che è compreso tra 6.0 e 6.5.

Anche nel caso della valutazione della quantità di nitriti, nitrati e ammonio, si procede con un metodo di tipo colorimetrico, basato su strisce reattive QUANTOFIX (presenti nel kit). La determinazione della quantità di nitriti e nitrati viene fatta utilizzando l’estratto A come campione.

Si versano 16.8ml di estratto A all’interno di una provetta e si immerge la striscia reattiva per circa 1 minuto. Passato il minuto si toglie la striscia e si lascia agita delicatamente per asciugarla, fino allo sviluppo di una colorazione rosa. Si confronta il colore della striscia con la scala colorimetrica presente nello stick di strisce QUANTOFIX Nitrate e si annota il contenuto di nitrati e nitriti.

Dalla nostra analisi emerge che il valore di nitrati è di 80 mg/l e il valore di nitriti è di 1mg/l. Per esprimerli in mg/kg N (kg di azoto) viene moltiplicato per 0.23 il valore di nitrati e per 0.30 il valore di nitriti. I nostri valori corretti sono: nitrati 18.4 mg/kg N e nitriti 0.3 mg/kg N.

Per la determinazione dello ione ammonio, si procede prima con la preparazione della matrice da analizzare. Si prende una provetta da 5 ml e si riempie con l’estratto A. Dopo di che si aggiungono 10 gocce di una soluzione NH₄-1 (presente nel kit) e si agita con cura. Successivamente si immerge la striscia reattiva presente nello stick QUANTOFIX Ammonium per 5 secondi. Si toglie la striscia e si confronta il colore con la scala colorimetrica presente sullo stick.

Dalla nostra analisi risulta che il valore di ione ammonio è di 0.1 mg/L. Per esprimerlo in mg/kgN si moltiplica questo valore per 0.78. Il valore estrapolato è di 0.078 mg/kg N.

Come stabilito precedentemente, per la determinazione del fosforo, potassio e del tipo di suolo (sabbioso, argilloso o limoso), si è proceduto preparando inizialmente una soluzione di estrazione B, costituita da 100ml di soluzione madre CAL (presente nel kit) e 0.4 L di acqua distillata. Una volta preparata si agita ed è pronta per l’uso.

A questo punto si pesano 10g di suolo trattato precedentemente e si versano in un flacone di plastica. A questi 10g vengono aggiunti 200ml di soluzione di estrazione B. La nostra miscela viene agitata e viene lasciata riposare per 5 minuti per favorire la sedimentazione. Successivamente viene sottoposta a filtrazione, utilizzando un filtro a pieghe MN 616 ¼ . Dopo filtrazione ottieniamo un filtrato che corrisponde al nostro estratto B. L’estratto B viene utilizzato per la determinazione del fosforo e del potassio.

L’analisi del fosforo viene effettuata con metodo colorimetrico VISOCOLOR ECO Phosphate.

Si allestiscono due tubi di misurazione e si inseriscono nel blocco VISOCOLOR inserendo nel perno un disco rotante colorato per la determinazione della quantità di fosfati. Con l’aiuto di una siringa, si trasferiscono 1.6 ml di estratto B all’interno dei due tubi e si porta a volume con acqua distillata (alla linea nera). Il tubo di destra viene trattato prima con 6 gocce di soluzione P-1 e poi successivamente con 6 gocce di P-2 (entrambe le soluzioni sono nel kit). Il tubo di sinistra, invece, viene trattato con 6 gocce di una soluzione P-K (fornita nel kit). Si agitano i due tubi e si lasciano nel blocco per 10 minuti fino alla comparsa di una colorazione blu. Si effettua una comparazione colorimetrica, tra il colore dei tubi e la scala colorimetrica sul disco rotante colorato.

Nel nostro caso non c’è nessuna colorazione, quindi possiamo dedurre che non sono presenti fosfati.

Il potassio viene analizzato nefelometricamente, attraverso la valutazione del parametro torbidità. La torbidità può essere determinata o con metodo visivo o, con maggiore precisione, con metodo fotometrico. Nel nostro caso la valutazione della torbidità è avvenuta con metodo visivo. Si procede riempendo una provetta con l’estratto di suolo B fino al segno dell’anello (16.8 ml) e si aggiungono 15 gocce di reattivo K-1. Si agita e si aggiungono 15 gocce di reattivo K-2 (entrambi presenti nel kit). Si agita per 30 secondi energicamente fino a quando non si vedono tracce di reattivo.

Successivamente si versa il liquido all’interno del tubo di campionamento del potassio (presente nel kit) fino a quando la croce presente sul fondo del tubo di misurazione non diventa invisibile (guardare il tubo dall’alto). Si legge il contenuto di potassio dalla scala presente sul tubo di misurazione, prendendo come punto di riferimento il bordo inferiore al menisco, e si annota il valore.

Dalla nostra analisi risulta che il valore di potassio è di 6.1 mg/L. Per avere il risultato in mg/kg K (kg di potassio) si moltiplica il valore per 20. Quindi nel nostro caso abbiamo un valore di 120 mg/kg K.

All’analisi dei parametri chimico-fisici del suolo, segue un’analisi microbiologica del suolo, per la determinazione della microflora del suolo, attraverso la quantificazione della carica microbica aerobia presente nel suolo.

Per prima cosa si pesano 10 g di suolo e il campione va lasciato essiccare per 24 h. Trascorse le 24 ore, si inseriscono i 10 g di terreno in una beuta e si aggiungono 100 ml di una soluzione tampone di cloruro di sodio (NaCl) allo 0.9%. La soluzione tampone evita lo shock osmotico, che si avrebbe se si utilizzasse l’acqua distillata. Si agita la beuta e si lascia sedimentare sul fondo le particelle di suolo.

Nel frattempo si prepara un terreno di coltura per la crescita dei microrganismi. Nel nostro caso abbiamo utilizzato NUTRIENT AGAR, che è un terreno di coltura generico, che favorisce la crescita di moltissimi microrganismi.

La composizione di questo terreno è:

-          Estratto di carne 3 g

-          Peptone 5 g

-          Agar 15 g

-          Acqua distillata 1000 ml

Prepariamo 250ml di terreno e lo sterilizziamo mediante l’utilizzo dell’autoclave a 121 gradi centigradi per 15 minuti. All’interno dell’autoclave inseriamo 5 tubi contenenti 9 ml di acqua distillata, che ci serviranno per le diluizioni.

Una volta sterilizzato il nostro materiale, procediamo con una metodica indiretta per la quantificazione dei microrganismi presenti nel nostro campione di suolo: la tecnica MPN (Most Probable Number). Si parte dall’inoculo (10g di suolo in 100ml di tampone) e si allestiscono 5 tubi da 9 ml di acqua distillata. Con l’utilizzo di una pipetta, si preleva 1ml dall’inoculo e si trasferisce nel primo tubo. Poi si prende 1 ml dal primo tubo e si mette nel secondo e così via. In questo modo effettuo delle diluzioni in base 10, partendo da 10^-1 fino a 10^-5. Questo perché il mio campione iniziale contiene un numero di cellule microbiche troppo elevato per essere contato.

Per poter effettuare una quantificazione il più possibile corretta del numero di cellule microbiche, si dovrebbero utilizzare piastre che contengono un numero di colonie (UFC) da 30 a 300.

Una volta raffreddato il terreno, si procede con la tecnica di semina per inclusione, ovvero si pone 1 ml di campione (tubo di diluizione) al centro di una piastra Petri e si versa sopra il terreno. Dopo di che, con movimento rotante, si distribuisce uniformemente il campione seminato su tutta la superficie della piastra, in maniera tale che il campione entri in contatto con il terreno di coltura versato in piastra. Questa operazione si ripete per tutti i tubi di diluizione. Una volta eseguita la tecnica di semina, si lascia solidificare il terreno (l’agar è un agente solidificante) e si incubano le piastre ad una temperatura di 37 gradi centigradi per 24-48 ore. Durante il periodo di incubazione i microrganismi presenti nella piastra cresceranno e svilupperanno colonie, che verranno conteggiate in un secondo momento.

Passate 48-76 ore, si analizzano le piastre che contengono un numero di colonie tra 30 e 300. Nel nostro caso la piastra che aveva un numero di colonie in quel range era la piastra in cui l’inoculo era stato diluito di un fattore di 10^-4.

Piastra Petri contenente i microrganismi aerobi dopo incubazione (Piastra con diluizione 10^-4).

Il nostro campione era rappresentato da 10g di suolo in 100 ml di una soluzione fisiologica di NaCl 0.9%. La quantità di campione prelevata per le diluizioni seriali in solido era di 200 microlitri.

Il terreno colturale utilizzato per la crescita dei batteri aerobi era il NUTRIENT AGAR e le piastre sono state incubate a 37 gradi centigradi. Dopo incubazione procediamo con la fase di conta.

Abbiamo ritenuto opportuno contare le repliche con numero di diluizione 10^-4. Nelle due piastre il numero di colonie era rispettivamente di 44 e 46 ufc.

Conta delle colonie in piastra

Calcoliamo il numero di colonie contenute in 1ml di campione:

44:200=x:1000àx=220

46:200=x:1000àx=230

Siccome la diluizione era di 10^-4, moltiplichiamo per 10⁴ e quindi abbiamo ottenuto:

Prima replica: 220x10⁴

Seconda replica: 230x10⁴

Per sapere il numero di cellule presenti in entrambi le repliche, devo fare il logaritmo decimale delle UFC e quindi avrò:

Prima replica: logUFC/ml= log 220x10⁴ à x= 6.34x10⁴

Seconda replica: logUFC/ml= log 230x10⁴àx= 6.36x10⁴

Successivamente, per avere un numero di cellule il più possibile accurato, calcolo la media e la deviazione standard dei valori precedentemente ottenuti e quindi avrò:

X medio= 6.34+6.36/2àX= 6.35x10⁴   DS=0.01     (6.35x10⁴-0.01; 6.35x10⁴+0.01) UFC/ml

Il valore ovviamente fa riferimento ad 1 ml di soluzione, ma noi lo dobbiamo esprimere in 100 ml e quindi diventa:

6.35:1=x:100     per cui:   x=635x10⁶ oppure: 6.35x10⁸ UFC/ml.

Possiamo riassumere i valori in una tabella: